PCR用酵素 その１

皆さんはPCRを行うときにはどの酵素を使っていますか？
今日の記事はPCR用ポリメラーゼについてです。

PCR用ポリメラーゼは主に２つの種類に分かれます

１つ目はTaqポリメラーゼです。
TaqポリメラーゼはPCR用酵素の主力で最も広く使われています。
好熱細菌のThermus aquaticusから単離されたので頭文字部分をとってこの名前があります。
PCR法の開発初期に初めて採用された耐熱性ポリメラーゼもこのTaqポリメラーゼです。

Taqポリメラーゼ

Taqポリメラーゼを使用したPCR反応では増幅後の産物DNAの両３’末端にA（アデニン）が付加されます（A突出）。このポリメラーゼで増やしたDNAをクローニングする時は末端にT突出をもつプラスミド（T-Vector）とのライゲーション（TAクローニング）を行います。ライゲーション効率が良いためPCR産物のクローニングが容易なこともTaqポリメラーゼがPCRの主力となっている一因でしょう。
（参考リンク → T-Vectorを使ったサブクローニング）

２つ目は校正機能付きポリメラーゼです。
校正（プルーフリーディング）機能があるのでPCRエラーにより増幅DNA産物に変異が入る確率が格段に低くなっています。代表的なものはPfuポリメラーゼです。
校正活性をもつポリメラーゼはいろいろあり各メーカーが独自の商品を販売しています。通常のTaqポリメラーゼの５０倍以上の正確性を持つものも有ります。

Phusionポリメラーゼ。Taqの50倍の正確さ

。

増幅産物の末端には塩基の突出はないので（平滑末端）、クローニングのためには平滑末端を持つベクターとのライゲーション（Blunt-end cloning）が必要です。TAクローニングに比べてライゲーション効率が落ちるため簡便性ではTaqポリメラーゼに負けます。

以上主に２つに大別できるPCR用酵素ですが、実際には増幅効率や正確性が少しずつ違う酵素が多くのメーカーから販売されています。

僕はPCR用酵素をいくつか持っていますが、実験の用途ごとに使い分けています。それぞれが少しずつ違った特徴を持っていて、使い分けることにより実験が容易になり費用も抑えられます。

では１つずつ説明していきましょう。


第１グループ
目的：　とにかく増えればいい時用です。
用途：　大腸菌のコロニーダイレクトPCR。PCR産物のダイレクトシークエンス。

この用途には低価格であること、増幅効率が良いことが必須条件です。インサートの長さがわかれば良いコロニーダイレクトPCRや、配列がわかっている部分を増幅してPCR産物をそのままシークエンスにかけて確認するときなど主にチェック用途です。

Paq5000ポリメラーゼ

多数のサンプルを処理するため経済性を考えてとにかく安価な酵素が良いです。また大腸菌のコロニーなどの精製していないサンプルから目的DNAを増やしたいので悪条件でも増える増幅効率の良さも重要なポイントです。

（参考リンク→コロニーダイレクトPCR)

この部類にはいる酵素の１つはAgilentのpaq5000ポリメラーゼです。Taqではありません。Paqです。Pyrococcus属の細菌から採られたポリメラーゼです。

この酵素は増幅効率がとても良く、精製していないDNAサンプルからのPCRなど悪条件でもとにかくよく増えてくれます。コロニーダイレクトPCRにはもってこいの酵素です。

伸長反応にかかる時間がTaqポリメラーゼの半分と短いので（30sec/kb） PCRに要する時間はぐっと短くなります。添付されている反応バッファーの工夫によって比較的長鎖（～6kb）のDNAを増幅できるようになっています。一方でPCRエラーはそれなりに入るのでクローニングにはあまり向きません。

価格を考えるとユニットあたり10～22円（パッケージ容量により変動）とかなり安く設定されていて大量サンプルの反応を安価に行うことができます。この酵素が少し前までは定価では一番安い酵素でした。

さらに安い酵素は調べた限りではNEBのTaqポリメラーゼしかありません。これは次の第２グループの酵素ですが、昨年の価格改定で最も安い酵素になりました。ユニットあたり6.5～15円とPac5000を抜きました。

最も少ないパッケージ容量（アジレントPaq5000は500U、NEB Taqは400U）で比較すると２２円（Pac）と１５円（NEB）で７円も差があります。増幅効率ではPaq5000に軍配が上がるのですが、価格面でもアジレントにぜひとも頑張ってもらいたいところです。

Emerald Ampは電気泳動用の色素入り。

TAKARAのEmeraldAmpはポリメラーゼと反応バッファー、dNTP、ゲル泳動用の色素があらかじめ添加された2倍濃縮のpremixタイプの酵素です。あとはプライマーとテンプレートを混ぜるだけです。特許関連資料から推測して複数の酵素を混合しているタイプのようですが、どの酵素が入っているのかはよくわかりません。

Premixタイプなので価格の比較が難しいですが、50uLの系で160回分が定価6400円（消費税5％時）なので反応系が少なくてよい用途ではかなりコストパフォーマンスがよくなると思います。反応後にそのままゲルにアプライして泳動できる点も便利です。


第２グループ
目的：　普通のPCR用です。
用途：　遺伝子のクローニング。精製したDNAからのPCR等　ほか様々な用途。

使用頻度の高いグループです。基本的には精製されたDNAからPCR反応を行う場合に使っています。正確性も普通で値段も普通です。あまり長い遺伝子でない限りはクローニングに使ってもそれほど変異は入りません。PCR産物をそのままシークエンスにかける場合にも使えます。

ノーマルTaq

このグループの酵素はほぼTaqポリメラーゼです。NEB, Promega, LifeTechnologiesなど様々なメーカーからTaqポリメラーゼという名前で販売されています。TAKARAのみrTaq （recombinant Taq）とラベルしてありますが同じです。

各社の製品であまり違いはないと思います。だいたいどれでも増え方やエラーの率は同じでしょう。
値段はNEBのTaqが定価では一番安いです。LucigenのEconoTaqという製品もなかなか安いようです。

プロメガのGoTaqには反応液にゲル泳動用の色素が含まれているタイプの製品がありPCR反応後そのまま電気泳動を行うことができるので便利です。

メーカーによっては価格がかなり安くなっています。NEBのTaqポリメラーゼなどは対象とするサンプルがきちんと増幅されれば第１グループと同じくチェック用途にもどんどん使っていいとおもいます。

次回に続きます。（→PCR用酵素　その２）