リアルタイムPCRとネガコン

グレイト！！

 
皆さんこんにちは。

僕が学生のときになぜか時々混入してくるプラスミドがありました。
実験で使っているプラスミドにインサートを組み込んだ後、大腸菌に形質転換して、青/白セレクションで白コロニーをとってくる。そしてそれを液体培地で増やして、プラスミドを抽出し、電気泳動すると・・・

「・・・なんだきみは？」

長さも制限酵素切断パターンも何もかも使ったものとは違うプラスミドが増えている。

白コロニーの多くは正しいのですが、時々そのへんなプラスミドが混ざっていることがあるのです。これを僕らの研究室では謎プラとよんでいました。謎プラに該当するプラスミドが何なのか制限酵素切断箇所やプラスミドのサイズなどからいろいろ調べてみたのですがわからずじまい（シークエンスまではやりませんでした）。結局あいつは何だったのだろうか。今でも謎のままです。

おそらく試薬や水など、どこかに謎プラが混入（コンタミ）していたのでしょう。あるいは形質転換に使った大腸菌の中にもともと入っていたのかもしれません。 この時はコンタミの頻度が低かったため正しいプラスミドを選んで実験すればよかったので、それほど害はありませんでした。しかし実験の内容によってはコンタミが多大な影響を与える場合があります。

その１つがリアルタイムPCRを使った定量実験です。




前回の投稿で紹介しましたが、先日リアルタイムPCRを使った定量実験の実技トレーニングコースをおこないました（→ リンク）。参加者の皆さんに実際に実験してもらい、技術を習得してもらう講習会です。

普通のPCR実験だと、難しいターゲットでない限りプロトコールや試薬の添付書類等を見て実験を行えば多くの場合目的のDNAがどっさりと増え、電気泳動でバンドを確認できたら成功です。

ネガコンなのに増える。特にはじめの２つのサンプルはかなりのコンタミの模様。

しかしリアルタイムPCRでは反応中に目的のDNAが増えていく過程を装置の検出器で捉え、その増幅過程を比較することでサンプル中の目的DNAの量を算出します。微量のDNAの混入で増幅率が変わってしまうため、実際の量よりも多く算出してしまうことになります。間違った実験結果を得ることになるためコンタミにはかなりの注意を払わないといけません。

コンタミの有無はネガティブコントロールを測定することで判断できます。

DNAの代わりに水をいれてリアルタイムPCRを行い、何も増えてこなければ良いことになります。しかしながら水しか入れていないにも関わらずサイクル数が増えてくるとDNAの増幅が検出されることがあります。ネガコンで増えるということは実際のサンプルにもコンタミしている可能性が高いので実験結果を正しく解釈できなくなります。

プライマーの配列によってはプライマーダイマーが増えていることもあるのですが（この場合はプライマーの再設計になる）、PCR産物を電気泳動でチェックすると長さから判断してターゲットとするPCR産物が増えている。そう、コンタミです。皆さんの実験ではどうでしょうか？

ネガコン（水）で増えないことはリアルタイム定量PCR実験ではとても大事です。しかし実際の実験では増えてくることが多いのです。どうすればよいのか。

もし水でも増えてくる方、次回必見です。
（リンク→リアルタイムPCRとネガコン２）

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補足１：コンタミの有無を判断するためのネガコンは水を入れて反応を行いますが、RNAを抽出した時に一緒にゲノムDNAが混ざって抽出されていた場合にも予期せぬ増幅が起こることがあります。特に両方のプライマーが同じエキソン内に設計されていたり、イントロンを挟んでいる場合でもその長さが短い場合には要注意です。

この時のネガコンは逆転写反応なし（no-RT）のサンプルをテンプレートに増幅反応を行います。逆転写反応時に逆転写酵素のみを入れずに（代わりに同量の水などを入れる）調整したものです。

No-RTからの増幅がごく少ない場合には（実験サンプルのCt値との差が増幅率にもよるが8～10くらい）であればゲノムDNAからの増幅の寄与率が１%以下になるので実験的には無視しても良いと思いますが、もしそうでない場合には解決しなければなりません。

長いイントロンを挟むようにプライマーを再設計するとゲノムDNAからの増幅は起こりません。しかし遺伝子によってはそのような設計が不可能な場合があります。

その場合には抽出後のRNAに混入したゲノムDNAをDNA分解酵素（DNase I）で除去します。DNase Iのみを購入してもいいのですが、分解反応後の精製が大変なので逆転写キットにDNase Iが同梱されているものが便利です。僕はTOYOBOの製品（ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover）を使っています。

補足２：先日の講習会で使ったリアルタイム定量PCR実験のプロトコールはゲノム研究分野ホームページからダウンロードできます。こちら（→リンク）のページから「マニュアル・プロトコール」を参照。実験の参考にしてみてください。

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